Итак, осуществлен гидролиз полисахарида и получены составляющие его моносахариды или метилированные сахара. Теперь надо установить их строение. Задача эта все еще достаточно сложна и трудоемка (хотя и проще, чем установление строения самого полисахарида). Поэтому, прежде чем непосредственно браться за ее решение, следует подумать, нельзя ли установить строение …, не занимаясь установлением строения? Часто оказывается, что можно. В арсенале органической химии есть такой прием, который позволяет прийти к определенным выводам о структуре молекулы без ее последовательной экспериментальной расшифровки. Этот прием называется идентификацией вещества.
Научный потенциал, накопленный человечеством к сегодняшнему дню, состоит не только в огромных общих знаниях, могущественных методах исследования и совершенных приборах. В него входят также сведения о точных, хорошо воспроизводимых физических характеристиках гигантского числа органических соединений, в том числе моносахаридов и их производных, строение которых уже было установлено определенно и надежно. И если нам удастся доказать, что полученный из неизвестного полисахарида моносахарид тождествен или, как чаще говорят, идентичен известному моносахариду, мы тем самым установим строение этого моносахарида. Доказательство идентичности двух веществ – идентификация – есть один из важнейших во всей органической химии принципов исследования, а применяемые для этой цели методы и приемы постоянно совершенствуются и развиваются. Как же практически идентифицировать органическое соединение, в частности моносахарид?
Прежде всего можно определить его физические константы. Самые обычные и легко измеряемые из них – температура плавления и удельное вращение. После этого пора обратиться к литературе – не был ли описан ранее моносахарид с такими константами? И если окажется, что был описан, у исследователя появляется, нет,не уверенность, но только основание для предположения о том, что его моносахарид идентичен известному, и, следовательно, право предположительно приписать ему определенную структуру. Почему же только предположительно? А вот почему.
Прежде всего, точность определения этих констант и их воспроизводимость сравнительно невелики. Реально обе эти величины могут быть измерены с помощью обычных приборов с ошибкой, достигающей 1-2 °. Сами же величины зависят от чистоты образца, а она может быть различной у нашего исследователя и у того, кто впервые описал это вещество в литературе. Так что даже для безусловно идентичных веществ расхождение в температурах плавления и величинах удельного вращения вполне может достигать 2-3 °. Температуры плавления моносахаридов, например, лежат обычно в интервале примерно 50-200 °. При допустимой ошибке в 3 ° это означает всего около 50 различных температур плавления. Иными словами, вероятность случайного совпадения этой константы – порядка 2%. Это, конечно, недопустимо много. Не намного лучше обстоит дело с удельным вращением. Для большинства моносахаридов удельные вращенияумещаются в интервале от -100 ° до +100 °, т.е. вероятность случайного совпадения удельного вращения разных соединений опыть около 1-2%. Таким образом, даже совпадение обеих этих констант для двух моносахаридов может оказаться случайным с вероятностью в несколько сотых процента. Такая вероятность ошибочного вывода об идентичности все еще велика, для того чтобы серьезный ученый мог ею удовлетвориться. Ко всему прочему нужно добавить, что очень многие моносахариды, а особенно метилированные сахара весьма трудно получить в кристаллическом состоянии, причем сделать это тем труднее, чем хуже очищено вещество и чем меньшим его количеством располагает исследователь. А если нет кристаллов, то нельзя и определить температуру плавления.
Остаются еще, конечно, и другие характеристики вещества: его спектры, цветные реакции, некоторые особенности химического поведения. Однако, во-первых, они обычно менее индивидуальны и характерны для данного соединения, во-вторых, далеко не для всех соединений с известной структурой описаны в литературе (в отличие от двух самых распространенных: температуры плавления и удельного вращения). Таким образом, «заочная» идентификация соединения по литературным данным – вещь мало надежная. Совсем другое дело – держатьв руках два образца: неизвестного вещества и известного, устроить им, так сказать, очную ставку. В научной литературе это называется «идентифицировать вещество путем прямого сравнения с заведомым образцом». Здесь возможности для надежной идентификации резко расширяются.
Прежде всего, существует общая закономерность: два разных вещества могут случайно иметь одинаковые температуры плавления, но их смесь обязательно будет плавиться при другой температуре. Только смесь двух идентичных веществ (которую в сущности вообще нельзя назвать смесью, разве что смесью двух образцов) имеет точно такую же температуру плавления, что и исходные компоненты. Так что отсутствие депрессии температуры плавления – чрезвычайно простой и очень надежный метод идентификации двух веществ при прямом сравнении. Для этого, однако, нужно иметь чистое кристаллическое вещество, а это не всегда удается.
В таком случае вступает в свои права комплекс мощных аналитических методов – хроматография. Это способ анализа веществ, основанных на их физическом разделения. Например, при хроматографии на бумаге вещества двигаются по хроматограмме с током растворителя с различными скоростями, индивидуальными и характерными для данного вещества в данных условиях. Последняя оговорка весьма существенна: в разных лабораториях и в разных руках точно воспроизвести абсолютные скорости – их называют хроматографическими подвижностями – весьма и весьма трудно. Поэтому здесь не обойтись литературными данными – нужно прямое сравнение двух образцов.
Огромное достоинство хроматографических методов в том, что они позволяют работать с очень малыми количествами вещества (например, порядка микрограмма) и, что еще важнее, позволяют идентифицировать не только мало очищенные вещества, но даже вещества, присутствующие в качестве компонентов сложных смесей. Последнее особенно существенно для разбираемой нами задачи, так как, например, гидролизат полисахарида может содержать несколько разных моносахаридов. И хроматография позволяет идентифицировать их без предварительного разделения.
Конечно, и хроматографические методы могут дать осечку: подвижности разных веществ могут и случайно совпасть. Однако хроматография – это очень гибкий метод. Можно использовать набор разных условий для анализа одной и той же пары веществ,а совпадение подвижностей в нескольких различных условиях – это уже событие, вероятность которого ничтожно мала.
Кажется, все? Проблема идентификации моносахаридов решена? Не тут-то было! В одном и очень важном для химии углеводов пункте хроматографические методы бессильны: они не позволяют отличать правое от левого. Мы можем, например, со всей надежностью идентифицировать хроматографически галактозу, но останемся в полном неведении относительно того, D- или L-галактозу мы имеем.
Значит, нужно сделать еще что-то. Тут два пути. Можно выделить моносахарид (или его производное) в индивидуальном состоянии и определить его удельное вращение. А можно воспользоваться ферментом, катализирующим ту или иную реакцию этого моносахарида – уж ферменты-то отличают правое от левого! Но ферменты – реагенты тонкие и капризные. Надежный анализ с помощью ферментативной реакции требует проверки с применением образцов заведомых моносахаридов, вводимых в ту же реакцию с темже самым препаратом фермента. И вот тогда только у исследователя появляется действительная уверенность в том, что вещество – моносахарид – идентифицировано.
Мы видели, какую большую роль при идентификации играет прямое сравнение с заведомым образцом. Спрашивается, а где его взять? Промышленность реактивов выпускает специальные наборы образцов многих природных веществ, и в частности моносахаридов (разумеется, самых обычных и распространенных). Но это минимум, который гораздо ниже «прожиточного» при развитой исследовательской работе. Поэтому каждый исследователь, а также исследовательский коллектив, стремятся создать свою собственную коллекцию образцов веществ, пополняют ее при любой возможности и берегут как зеницу ока. Поэтому, в частности, столь значительно повышается эффективность исследовательской работы в больших коллективах: многие проблемы легко решаются путем обмена образцами известных веществ. Наконец, образцы известных соединений являются предметом международного обмена и сотрудничества. Неудивительно, что ученые часто получают письма примерно такого содержания: «Глубокоуважаемый доктор N! Не могли бы вы прислать нам несколько миллиграммов такого-то вещества для идентификации?». И в ответ летят в авиаконвертах через океаны и континенты считанное число драгоценных кристалликов. Поэтому научная статья нередко кончается словами: «Авторы глубоко признательны доктору N, любезно предоставившему заведомый образец такого-то вещества». И тут есть за что благодарить: иной раз один такой кристаллик позволяет исследователю сэкономить многие месяцы, а то и годы труда.
Предыдущая страница |
Следующая страница
СОДЕРЖАНИЕ