Синтез РНК на матрице РНК
ДНК-зависимая РНК-полимераза может осуществлять транскрипцию ДНК нормальных клеток и ДНК-вирусов. Как же осуществляется синтез РНК у тех вирусов, которые в геноме вместо ДНК содержат РНК? Оказывается, в этих случаях вирусная РНК индуцирует образование в клетках хозяина (например, у Е. coli) РНК-зависимой РНК-полимеразы, которая участвует в репликации вирусной РНК (отсюда второе название фермента – РНК-репликаза). Фермент также используется нуклеозидтрифосфаты для синтеза одноцепочечной вирусной РНК. Этот синтез должен пройти через стадию образования репликативной формы. Следовательно, на I стадии РНК-репликаза на матрице РНК-вируса специфически строит комплементарную, с противоположной полярностью цепь РНК. Последняя на II стадии служит матрицей для синтеза РНК, совершенно однотипной исходной вирусной РНК. Обе стадии катализируются одним и тем же ферментом, хотя в каждой из них участвуют различные белковые факторы. Следует особо подчеркнуть, что, поскольку РНК-репликаза имеет отношение только к вирусам, очевидно, на этом основании могут быть разработаны эффективные антивирусные лекарственные препараты.
Синтез РНК из нуклеозиддифосфатов. М. Грюнберг-Манаго и С. Очоа в 1955 г. в клетках Е. coli открыли особый фермент – полинуклеотид-фос-форилазу. Этот фермент наделен способностью синтезировать in vitro полимерную молекулу РНК из однотипных или разных рибонуклеозид-дифосфатов (НДФ). Реакция, являющаяся обратимой, протекает по уравнению:
(НМФ)n + НДФ –> (НМФ)n+1+ Н3РO4.
Рибонуклеозидтрифосфаты и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты не являются субстратами фермента. Фермент не нуждается в матрице, однако для синтеза необходима затравочная цепь РНК (НМФ)n со свободной 3'-гидроксильной группой, к которой присоединяются остатки моно-нуклеотидов. Образовавшаяся полимерная молекула РНК не имеет заданной специфической последовательности мононуклеотидов, но содержит 3'–>5' фосфодиэфирные связи, легко разрываемые рибонуклеазой. Относительно биологической роли этого фермента у бактерий предполагают, что он катализирует, скорее всего, обратную реакцию – расщепление мРНК с образованием нуклеозиддифосфатов.
Полученные в лаборатории С.С. Дебова данные свидетельствуют о более широком распространении полирибонуклеотид-фосфорилазы в живых организмах, чем это признавалось ранее. Фермент открыт также в клетках животных. Кроме того, получены экспериментальные доказательства синтетической функции полинуклеотид-фосфорилазы. Вполне правомерно допущение, что этот фермент может принимать участие в синтезе коротких полирибонуклеотидов в клетках эукариот в норме и в некоторых экстремальных условиях. Кроме того, в лабораторных условиях фермент может найти применение для синтеза РНК-праймеров, используемых далее при синтезе ДНК.
Проблемы генетической инженерии. Генетическая инженерия, по определению А.А. Баева, представляет собой систему экспериментальных приемов, позволяющих создавать в лаборатории (в пробирке) искусственные биологические структуры. В качестве инструментов для генно-инженерных операций применяются созданные самой природой ферменты: одни из них рассекают молекулу ДНК в строго определенных участках (рестриктазы), другие, напротив, сшивают разрозненные участки в единое целое (лигазы). Конечной целью генетической инженерии является получение организмов (животных и растений) с новыми наследственными свойствами с помощью лабораторных приемов. Для достижения этой пока еще отдаленной цели необходимо проведение огромной работы на уровне отдельного гена или генов. Ген, представленный определенным участком ДНК и соответствующий определенному белку, можно или выделить из другого организма, или синтезировать химическим либо биологическим путем. Впервые в 1969 г. из Е. coli был выделен участок ДНК с геном, ответственным за синтез фермента, катализирующего усвоение молочного сахара (лактозы),– так называемый лактозный оперон. Химический синтез гена аланиновой тРНК впервые осуществил Хар Гобинд Корана в 1970 г. Состоящий из 72 нуклеотидов, этот ген, однако, лишен функциональной активности, так как в клетках тРНК синтезируется не в готовом виде, а в форме предшественника. Эти данные послужили для Кораны основой для синтеза гена-предшественника тирозиновой тРНК (из 126 нуклеоти-дов), хотя сама тирозиновая тРНК состоит из 85 нуклеотидов. Ввиду громоздкости, а также недостаточной эффективности химического синтеза в последние годы все большее место занимают биологические методы синтеза генов при помощи обратной транскриптазы (ревертазы). Для этого необходимо иметь мРНК, с помощью которой можно воспроизвести соответствующий ген. Синтезированы ДНК-копии на мРНК, кодирующие синтез белка глобина (человека, кролика, мыши, голубя, утки), иммуноглобулина, белка хрусталика глаза и др. Однако на этом пути синтеза генов встречаются большие трудности, связанные с выделением из огромного разнообразия клеточных мРНК, нужной для синтеза гена.
Следующий этап генетической инженерии – перенос генов в клетку – осуществляется тремя способами: трансформацией (перенос генов посредством выделенной из клеток и освобожденной от примесей ДНК), трансдукцией (перенос генов посредством вирусов) и гибридизацией клеток, полученных из разных организмов (высших животных, микроорганизмов и др.) (рис. 13.7, 13.8). Заключительный этап этих экспериментов сводится к адаптации введенного гена в организме хозяина, но он почти не зависит от искусства экспериментатора.
Исследования в области генетической инженерии могут служить основой для решения практических задач здравоохранения и сельского хозяйства. Полученные в лаборатории искусственные гены, помимо широкого использования в микробиологической и фармацевтической промышленности для приготовления кормового белка и лекарственных препаратов (инсулин, интерферон, гормон роста, гормоны щитовидной железы, стимуляторы иммунитета и др.), возможно, смогут применяться при лечении многих наследственных заболеваний (их насчитывается около 5000), генетический дефект которых точно известен пока только для небольшого числа (не более 50) болезней.
Первые попытки применения лактозного гена при галактоземии (наследственное заболевание, связанное с непереносимостью галактозы вследствие отсутствия фермента гексозо-1-фосфат-уридилилтрансферазы; см. главу 10) вселяют надежду на реальные практические возможности генетической инженерии, хотя вполне обоснованы тревога и опасения, связанные с вмешательством человека в сферу тончайших биологических процессов наследственного аппарата целостного организма. В последние годы, после бурного периода расцвета, в генетической инженерии наблюдается некоторый спад, обусловленный недостаточностью знаний о структуре и функционировании генома клеток эукариот. Переход от исследований на клетках прокариот к исследованиям на клетках эукариот оказался затруднен рядом технических сложностей вследствие мозаич-ности структуры генов последних. В частности, открытие экзонов и интронов в геноме , явления сплайсинга (формирование зрелой матричной РНК) указывает на необходимость соблюдения высочайшей точности процедуры вырезания необходимого гена из ДНК генома соответствующими рестриктазами. В противном случае могут быть получены не структурные транслируемые гены, а интроны или участки экзонов, не кодирующие белок. После того как были разработаны методы искусственного синтеза и сшивки отдельных участков молекулы ДНК, появилась возможность конструирования и создания новых, неизвестных ранее в природе организмов с заранее заданными свойствами. Современная биотехнология явилась логическим развитием этого направления науки. Она сложилась на основе фундаментальных достижений биохимии, генетики и микробиологии, открыв широкие возможности для создания новых сортов растений, новых пород животных и т.п. Учитывая исключительную важность биотехнологии для народного хозяйства, в 1985 г. в нашей стране был создан и успешно работает межотраслевой научно-технический комплекс (МНТК) «Биоген». Комплекс был призван обеспечить создание и организацию промышленного производства новых биологически активных веществ и препаратов для медицины, ветеринарии, растениеводства на основе прогрессивных биотехнологических методов, в том числе методов клеточной и генетической инженерии.
Рис. 13.7. Схематическое изображение двух способов введения генов в клетку – трансформации и трансдукции (по А. А. Баеву).
Рис. 13.8. Получение гибридной молекулы, содержащей одновременно ДНК вируса SV40, ДНК фага λ, и галактозный оперон (схема по А.А. Баеву).
Под действием эндонуклеазы R1Е. coli кольцевые ДНК разрываются в одной точке, в результате образуются линейные нити. Под действием другого фермента - экзонуклеазы (из фага) укорачиваются нити ДНК с противоположных концов. Далее при помощи фермента концевой трансферазы наращиваются нити ДНК, причем у одной ДНК новые концы состоят из адениловых (А), у другой - из тимидиловых (Т) остатков. При смешивании молекул концевые остатки А и Т образуют комплементарные пары, замыкая линейные молекулы в кольца. Вначале эти кольца содержат 4 разрыва, которые затем закрываются при участии еще одного фермента - ДНК-лигазы.
Предыдущая страница |
Следующая страница
СОДЕРЖАНИЕ