Эксклюзионная хроматография

ЭКСКЛЮЗИОННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ (ситовая хро-матография), жидкостная хроматография, основанная на различной способности молекул разного размера проникать в поры неионогенного геля, к-рый служит неподвижной фазой. Различают гель-проникающую хроматографию (элюент - орг. р-ритель) и гель-фильтрацию (элюент - вода).
Ддя эксклюзионной хроматографии используют макропористые неорг. или полимерные сорбенты. Для эксклюзионной хроматографии полярных полимеров неорг. сорбенты (силикагели и макропористые стекла) модифицируют кремнийорг. радикалами, а для эксклюзионной хроматографии гидрофильных полимеров -гидрофильными группами. Среди полимерных сорбентов наиб. распространены стирол-дивинилбензольные (для эксклюзионной хроматографии высокополимеров и олигомеров). Для гель-фильтрации биополимеров, прежде всего белков, используют гидрофильные полимерные сорбенты (сефадексы - декстраны с поперечными сшивками, а также полиакриламидные гели) или модифицированные полисахаридами макропористые силикагели.
Эксклюзионную хроматографию эффективно применяют при разработке новых полимеров, технол. процессов их получения, контроле произ-ва и стандартизации полимеров. Эксклюзионную хроматографию используют для анализа ММР полимеров, исследования, выделения и очистки полимеров, в т. ч. биополимеров.

где V₀ - объем пространства между частицами сорбента, V_p -объем пор сорбента.
Эффективным размером макромолекулы при эксклюзионной хроматографии является ее гидродинамич. радиус R, к-рый вместе с мол. массой полимера М определяет характеристич. вязкость полимера . Универсальную калибровочную зависимость V_R от произведения (ур-ние 2) впервые получил экспериментально Г. Бенуа, она имеет вид (рис. 1):

где А и В - константы. Ур-ние (2) одинаково справедливо для линейных и разветвленных полимеров, блок- и привитых сополимеров, олигомеров. Используя ур-ние Марка-Ку-на-Хувинка: где и а - табулированные константы, учитывающие взаимод. полимера с р-рителем и степень жесткости макромолекулы, можно перейти от универсальной зависимости (2) к рабочей зависимости (3) для исследуемого образца (рис. 2):

гдеС₂ = B(a+1).

Рис. 1. Универсальная калибровочная зависимость Бенуа для эксклюзионной хроматографии: - линейный полистирол; - разветвленный полистирол; (+) -звездообразный полистирол;- гетеропривитой сополимер полистирола и полиметилметакрилата; - полиметилметакрилат;- разветвленный полифенилсилоксан; -полибутадиен.

С др. стороны, получив экспериментально зависимость (2) с использованием полимерных стандартов (не менее 3 образцов), для к-рых известны М, и а, а также зависимость (3) для полимера с неизвестными константами, можно найти для него, а и константы С₁ и С₂. Можно определять зависимость (3) и непосредственно путем калибровки узкодисперсными (с известными М)и широкодисперсными (с известным ММР) стандартами. Располагая эксклюзионной хроматограммой и калибровочной зависимостью определяют ММР исследуемого полимера.

Рис. 2. Рабочая калибровочная зависимость для эксклюзионной хроматографии.

В области от V₀до V_T (объем колонки, доступный для р-рителя и молекул ниже определенного размера, соответствующего М_мин) рабочая зависимость имеет линейный (квазилинейный) характер. Соответствующие объемам V₀ и V_T мол. массы представляют собой пределы исключения - М_макс (молекулы большого размера, не проникают в поры сорбента) и М_мин, (молекулы небольшие, полностью проникают в поры сорбента). Эти величины, а также тангенс угла наклона линейной части калибровочной зависимости селективности разделения С₂ = V_p/lg(M_макс/M_мин)и степень ее линейности определяют качество сорбента для эксклюзионной хроматографии. Благодаря логарифмич. зависимости V от М селективность разделения dV/dM падает с увеличением М, поскольку С₂ = (dV/dM)M. Для разделения макромолекул с близкими М требуется сорбент, работающий в узком диапазоне М и обладающий высокой селективностью С₂. Сорбенты с порами одного размера теоретически способны разделять макромолекулы в пределах коммерческие сорбенты характеризуются . Ддя разделения макромолекул в большом диапазоне М нужны сорбенты с бимодальным и тримодальным распределением пор по размерам, обеспечивающие линейную мол.-массовую калибровочную зависимость в диапазоне М = 10^2,5 - 10^6,5. Селективность С₂ подобного сорбента (или специально подобранной смеси сорбентов) естественно ниже, чем унимодального сорбента, но ее делают максимальной для заданного диапазона Макс. селективность достигается увеличением объема перового пространства сорбента, у бимодального и тримодального сорбентов, кроме того,-оптимальным распределением пор по размерам. Важно, чтобы при разделении смеси макромолекул их наибольшая и наименьшая М находились в пределах М_МИН - М_МАКС характерных для данного сорбента. Иначе по краям хроматограммы при V_T и V₀будут выходить из колонки макромолекулы соотв. с ММ_МИНи ММ_МАКС, образуя ложные хроматографич. пики.

Механизм эксклюзионной хроматографии. Макромолекулы в р-ре представляют собой статистич. ансамбль (статистич. клубок). Их распределение между пористым сорбентом и р-ром контролируется изменением энергии Гиббса при переходе макромолекулы из р-ра в поры: где- изменение энтальпии макромолекулы вследствие взаимод. ее сегментов с пов-стью сорбента (матрицей геля);- уменьшение энтропии при переходе макромолекулы из р-ра в поры; Т - абс. т-ра. Разделение макромолекул происходит в эксклюзионном режиме, когда, a K_d, зависящий от соотношения размеров макромолекул и пор, меньше 1.
В критич. условиях, когда при переходе макромолекул из р-ра в поры сорбента энергия Гиббса не изменяется происходит полная компенсация потери энтропии макромолекулы благодаря увеличению энтальпии: т.е. переход макромолекулы из р-ра в поры энергетически безразличен. При>0 и K_d> 1 наблюдается адсорбционная хроматография. В критич. условиях все макромолекулы, независимо от М, имеют K_d= 1 и, не разделяясь, выходят из колонки при V_R = V_Т В эксклюзионной области при макромолекулы с большей М сильнее вытесняются из пор, т. к. их энтропия при переходе из р-ра в поры уменьшается в большей степени.
На рис. 3 показаны кривые зависимости от энергии взаимод. сегментов макромолекулы (см. Макромолекула) с пов-стью сорбента. Эти кривые для макромолекул с разным числом сегментов (N)пересекаются в точке критич. энергии Кривые левее точкиотносятся к режиму эксклюзионной хроматографии. Отсюда ясно, что эксклюзионная хроматография включает значит. область энергетич. зависимостей гдеимеет значения от до Чем меньше тем больше изменение при попадании макромолекулы в поры и, следовательно, разделение макромолекулы более селективно.

Рис. 3. Зависимость и для разных N(N₁ >N₂>N₃).

Гетерополимеры (сополимеры, функциональные олигомеры) можно анализировать как с помощью эксклюзионной хроматографии (когда у всех компонентов ), так и в условиях, когда у одного из компонентов В этих (критических) условиях указанный компонент представляет хроматографич. "невидимку" (его K_d не зависит от М). Последнее позволяет по законам эксклюзионной хроматографии анализировать ММР отдельных блоков блок-сополимера, ММР функциональных олигомеров (отдельно для каждого типа функциональности), а вблизи критич. условий получать с помощью эксклюзионной хроматографии. ММР олигомеров для каждого типа функциональности.
У макромолекул, несущих электрич. заряд (полиэлектролитов), наблюдаются схожие, но более сильные изменения в зависимости от рН и ионной силы элюента, Это происходит благодаря увеличению размеров молекул полиэлектролитов при их диссоциации и проявлению кулоновских взаимод. между зарядами на больших расстояниях, чем в случае действия дисперсионных или электростатич. сил. При увеличении рН выше 4 пов-сть силикагелей приобретает отрицательный заряд. Взаимод. с ней нейтральной макромолекулы остается эксклюзионным (режим эксклюзионной хроматографии), поликатион адсорбируется благодаря ионообменной сорбции, а полианион исключается из пор по законам ионной эксклюзии значительно сильнее, чем при обычной эксклюзии.
Для подавления нежелательных для эксклюзионной хроматографии явлений ионной эксклюзии и ионообменной сорбции модифицируют пов-сть сорбентов (для придания ей нейтрального заряда при рН > 4), увеличивают ионную силу р-рителя, ослабляя кулоновские взаимод., добавляют орг. р-рители, смещая тем самым рК полиэлектролита или изоэлектрич. точку у полиамфолитов. С др. стороны, ионообменную сорбцию и ионную эксклюзию можно использовать для разделения нейтральных макромолекул, полианионов и поликатионов одного размера. Поскольку диссоциация полиэлектролитов увеличивается с разбавлением их р-ров, то при эксклюзионной хроматографии макромолекулы на краях хроматографич. колонки, где их концентрация мала, диссоциируют и движутся по колонке не по законам эксклюзионной хроматографии, а по законам ионообменной сорбции и ионной эксклюзии в зависимости от заряда пов-сти сорбента и макромолекулы, что приводит к искажению формы кривой зависимости V и М (рис. 4), а также позволяет диагностировать наличие того или другого процесса.

Рис. 4. Эксклюзионная хроматография нейтральных макромолекул (а) и полиэлектролитов: ионная эксклюзия (б), ионообменная сорбция (в).

Эффекты, аналогичные ионообменной сорбции, но только в более слабой степени, могут наблюдаться при гидрофобных взаимод. макромолекулярных сегментов с модифицированной гидрофобными радикалами пов-стью сорбента или при электростатич. взаимод. поверхностных силанольных гидроксигрупп с функциональными группами полярных макромолекул. Все эти эффекты должны подавляться при проведении эксклюзионной хроматографии.

Техника эксклюзионной хроматографии. Для разделения макромолекул в режиме эксклюзионной хроматографии используют колонки двух типов: работающие в узком = 10² и широком (= 10⁴ — 10⁵ диапазонах. Колонки широкого диапазона M имеют широкое распределение пор сорбента по размерам (бимодальное, тримодальное). Это распределение подбирается т. обр., чтобы при заданных степени линейности калибровочной мол.-массовой зависимости и диапазона масс обеспечивалась наиб. степень селективности С₂. Можно также составлять колонки для широкого диапазона М из колонок первого типа.
Разные типы полимеров требуют спец. р-рителей для эксклюзионной хроматографии наиб. универсальный р-ритель - ТГФ (для эксклюзионной хроматографии полибутадиена, полистирола, полиметакрилата, полиакрилатов). ТГФ имеет низкую вязкость, однако требует очистки от пероксидов. Толуол, хлороформ и метилэтилкетон также широко используют в эксклюзионной хроматографии полимеров. Для эксклюзионной хроматографии полиолефинов применяют о-дихлорбензол и 1,2,4-трихлорбензол, а для полиакрилонитрила, полиэфиров и полиамидов - м-крезол, фторированные спирты и к-ты.
Калибровку колонок в диапазоне масс 5 х 10²- 1,5 х 10⁷ осуществляют с помощью стандартных узкодисперсных полистиролов. Выпускают также стандарты полиметилметакрилата, полиизопрена, полиэтилена, полиэтиленгликоля и биополимеров (декстран и др.).
Эксклюзионная хроматография осуществляется с помощью хроматографа, детектором служит спектрофотометр или проточный рефрактометр с предельной чувствительностью 5 х 10^-8 ед. рефракции, что соответствует концентрации полимера 5-10^-5 %. Обычно прибор работает при комнатной т-ре, однако эксклюзионная хроматография полиолефинов требует повышенной т-ры, что способствует увеличению селективности разделения, эффективности колонок и скорости анализа вследствие уменьшения вязкости подвижной фазы. Совр. хроматографы комплектуются автоматич. устройством для приготовления (растворение полимера, фильтрация р-ра) и ввода пробы, компьютером для интерпретации результатов анализа ММР. Концентрацию пробы (с) следует уменьшать с ростом М полимера: для полимера с М10⁴ с = 0,25 % по массе, 3 х 10⁴ - 2 х 10⁴ с = 0,1%, 4 х 10^{5 -} 2 х 10⁶ с = 0,05%, М>2 х 10⁶с = 0,01%.
Применение комбинации рефрактометрич. детектора и детектора многоуглового рассеяния света - фотометра позволяет определять ММР и индексы разветвленности без калибровки хроматографа по полимерным стандартам.
Эксклюзионную хроматографию применяют для исследования и выделения полимеров в диапазоне М 10² - 2 х 10⁷. Наилучшая селективность достигнута для олигомеров - выделяют олигомергомологи с числом звеньев до 10-15. Особенность эксклюзионной хроматографии олигомеров состоит в том, что на хроматограмме выходят пики для каждого из олигомергомологов, присутствующих в олигомере. Поэтому можно определять ММР олигомера без калибровки колонок, если известна М одного или неск. олигомергомологов.
При гель-фильтрации белков необходимо принимать меры для предотвращения их адсорбции на сорбенте и не допускать их денатурации. В отличие от эксклюзионной хроматографии синтетич. полимеров и олигомеров, используемой гл. обр. в аналит. целях, гель-фильтрация белков - один из важнейших способов их выделения и очистки. Разрешение белков по М при гель-фильтрации ниже, чем при гель-проникающей хроматографии синтетич. полимеров, т.к. для белков RМ ^1/3, а для гибкоцепных полимеров RМ ^1/2. Можно повысить чувствительность определения М белков методом гель-фильтрации, если проводить ее в условиях денатурации: в о М р-ре гуанидинхлорида (R ~ М ^1/2) или в р-ре додецилсульфоната Na (R ~ M).
Гель-фильтрацию открыли в 1959 Д. Порат и П. Флодин, к-рые показали возможность фракционирования водорастворимых макромолекул, в т. ч. белков, по мол. массе, в качестве сорбента они использовали сшитый декстрановый гель. В 1964 Д. Мур предложил с помощью гель-проникающей хроматографии определять ММР полимеров, фракционируя их на стирол-дивинилбензольном геле.

Лит.: Беленький Б.Г., Виленчик Л. 3., Хроматография полимеров, М., 1978; Нефедов П. П., Лавренко П. Н., Транспортные методы в аналитической химии полимеров, Л., 1979; Энтелис С.Г., Евреинов В. В., Кузаев А. И., Реакционноспособные олигомеры, М., 1985; Yau W.W., Kirkland J., Bly D., Modern size-exclusion liquid chromatog, raphy, N.Y., 1979; Belenkii B.G., Vilenchik L.Z., Modem liquid chromatognphy of macromolecules, Amst., 1983.

Б. Г. Беленький.